Badacze projektu CHOP opracowują wszechstronną, niedrogą technologię ukierunkowanego sekwencjonowania RNA z długim odczytem

– Łatwa do wdrożenia technologia zmniejsza koszt interakcji w przechwyceniu celu o 2-3 rzędy wielkości w porównaniu ze standardowymi rozwiązaniami komercyjnymi –

FiladelfiaI 15 sierpnia 2023 r /PRNewswire/ — Naukowcy ze Szpitala Dziecięcego przy ul. Filadelfia (CHOP) opracował wszechstronną i tanią technologię ukierunkowanego sekwencjonowania cząsteczek RNA pełnej długości. Technologia ta, zwana TEQUILA-seq, jest ekonomiczna w porównaniu z dostępnymi na rynku rozwiązaniami do ukierunkowanego sekwencjonowania RNA i może być dostosowana do różnych celów badawczych i klinicznych. Szczegóły są opisane w papierze W Komunikacja natury.

Na drodze od genu do białka cząsteczka RNA może być cięta i łączona na różne sposoby, zanim zostanie przekształcona w białko. Ten proces jest znany jako alternatywny splicing i umożliwia pojedynczemu genowi kodowanie kilku różnych białek. Chociaż alternatywny splicing występuje w wielu procesach biologicznych, może być rozregulowany w chorobach, takich jak rak, w wyniku czego powstają chorobotwórcze cząsteczki RNA. Aby zrozumieć, w jaki sposób alternatywny splicing może prowadzić do chorób, naukowcy muszą dokładnie policzyć wszystkie cząsteczki RNA (znane jako „izoformy”) emitowane z pojedynczego genu.

Jednym ze sposobów na to jest użycie platform do sekwencjonowania RNA „długiego odczytu”, które sekwencjonują cząsteczki RNA o długości większej niż 10 000 zasad od końca do końca, przechwytując całe izoformy transkryptu. Jednak te długo czytane platformy mają niewielką wydajność sekwencjonowania, co utrudnia ich powszechne przyjęcie, szczególnie w warunkach klinicznych, ponieważ generowanie długo czytanych danych sekwencjonowania RNA na klinicznej głębokości informacyjnej może być zbyt drogie. Sekwencjonowanie celu, które obejmuje wzbogacenie określonych sekwencji DNA będących przedmiotem zainteresowania przed sekwencjonowaniem, jest użyteczną strategią, która może znacznie zwiększyć zasięg wcześniej wybranych celów, ale koszt i złożoność wychwytywania celu stanowią bariery dla szerszego zastosowania.

„Ukierunkowane sekwencjonowanie RNA z długim odczytem jest potężną strategią adnotacji referencyjnych RNA dowolnego wcześniej zdefiniowanego zestawu genów. Jednak obecne techniki ukierunkowanego sekwencjonowania cząsteczek RNA pełnej długości są albo drogie, albo trudne do przygotowania, co sprawia, że ​​są one poza zasięgiem wielu współczynników” – powiedział współautor Ponieważ Lindr, adiunkt Patologia i medycyna laboratoryjna i członek Raymond G. Perelman Centrum Terapii Komórkowych i Molekularnych w CHOPie. „TEQUILA-seq rozwiązuje ten problem, ponieważ jest niedroga i łatwa w użyciu. Technologia może być dostosowywana przez użytkowników do różnych celów, a naukowcy mogą wybierać geny, które chcą zsekwencjonować i wytwarzać odczynniki do wychwytywania celu we własnych laboratoriach. Ma to potencjał przyspieszenia odkrywania nowych rozwiązań diagnostycznych i terapeutycznych dla szerokiego zakresu chorób.

Jedną z metod, która umożliwia ukierunkowane sekwencjonowanie, jest wzbogacanie oparte na hybrydyzacji, które wykorzystuje krótkie fragmenty kwasów nukleinowych zwane oligonukleotydami jako sondy wychwytujące. Te oligonukleotydy (często określane po prostu jako „oligo”) są znakowane cząsteczkami biotyny i zaprojektowane tak, aby hybrydyzowały z celami w oparciu o integralność sekwencji DNA, umożliwiając łatwe wychwycenie i wyizolowanie sekwencji docelowych z próbki biologicznej. Jednakże, chociaż wzbogacanie oparte na hybrydyzacji jest skuteczną metodą ukierunkowanego sekwencjonowania, komercyjnie syntetyzowane sondy wychwytujące są drogie i mogą być stosowane tylko w ograniczonej liczbie reakcji, co powoduje, że koszt próbki jest wysoki dla każdej reakcji wychwytu.

Aby zaradzić temu ograniczeniu, badacze projektu CHOP opracowali TEQUILA-seq (Wzbogacanie i kwantyfikacja transkrypcji za pomocą liniowo wzmacnianych sond izotermicznych w połączeniu z sekwencjonowaniem długiego odczytu). Główną innowacją w TEQUILA-seq jest izotermiczna reakcja amplifikacji z przemieszczeniem nici pochodząca z endonukleazy, która może syntetyzować duże ilości sond bioprzechwytywania z niedrogiej puli oligonukleotydów nietraktowanych biotyną jako matryc. Wykorzystując zaledwie 2 nanogramy wprowadzonych matrycowych oligonukleotydów, naukowcy mogą wygenerować 25 mikrogramów sond TEQUILA, które można wykorzystać w co najmniej 250 reakcjach wychwytu. Ta innowacyjna strategia dopasowania sond wychwytujących sprawia, że ​​TEQUILA-seq jest wysoce opłacalny i skalowalny dla dużych płytek docelowych i wielu próbek biologicznych.

Aby zmierzyć jego działanie, naukowcy przeprowadzili TEQUILA-seq wielu paneli genów na syntetycznych RNA lub ludzkich RNA. Sondy TEQUILA zostały wykonane, a także komercyjne sondy wychwytujące do wychwytywania i wzbogacania celu, a jednocześnie są setki razy tańsze w przeliczeniu na reakcję wychwytu. Co więcej, autorzy wykazują, że TEQUILA-seq może znacząco poprawić wykrywanie przy jednoczesnym zachowaniu kwantyfikacji docelowych cząsteczek RNA.

„Korzystając z niedrogich odczynników i łatwego przebiegu pracy eksperymentalnej, TEQUILA-seq pozwala nam głęboko sekwencjonować cząsteczki RNA pełnej długości dowolnego klastra genetycznego w wielu próbkach biologicznych” – powiedział współautor. Yi Xingdr, dyrektor Centrum Medycyny Obliczeniowej i Genomicznej w CHOPie. „To bardzo ekscytujące i umożliwia szeroki zakres zastosowań medycznych, od diagnostyki genetycznej opartej na RNA po opracowywanie terapii”.

Aby zademonstrować ich przydatność biomedyczną, naukowcy zastosowali TEQUILA-seq do scharakteryzowania cząsteczek RNA pełnej długości 468 aktywnych genów raka w 40 liniach komórkowych raka piersi. Odkryli nieznane wcześniej polimorfizmy transkrypcyjne w szeroko badanych genach raka, które mogą rzucić światło na to, w jaki sposób geny chroniące organizm przed rakiem są zakłócane w poszczególnych guzach.

„Nasza praca pokazuje, że TEQUILA-seq może być szeroko stosowany do ukierunkowanego sekwencjonowania cząsteczek RNA pełnej długości” – powiedział dr Lin. Co więcej, sondy TEQUILA są sondami wychwytującymi ogólnego przeznaczenia.Są kompatybilne zarówno z docelowym sekwencjonowaniem RNA, jak i DNA, zarówno na platformach sekwencjonowania długiego, jak i krótkiego odczytu.Zdolność do łatwego generowania dużych ilości sond wychwytujących biologicznie dla dowolnej płytki docelowej. Może tanio i łatwo ułatwić badania na dużą skalę na poziomie populacji dla wielu podstawowych, translacyjnych i klinicznych zastosowań”.

Ta praca była wspierana przez granty NIH (R01GM121827, R01GM088342, R56HG012310, U01CA233074, T32HG000046). Firma CHOP złożyła wniosek patentowy na technologię TEQUILA.

Wang i in. TEQUILA-seq: wszechstronna i tania metoda ukierunkowanego sekwencjonowania RNA z długim odczytem. Komunikacja naturyI 8 sierpnia 2023 rDOI: 10.1038/s41467-023-40083-6

O Szpitalu Dziecięcym w Filadelfii: Organizacja charytatywna non-profit, Szpital Dziecięcy przy ul Filadelfia Powstał w 1855 roku jako pierwszy szpital dziecięcy w kraju. Dzięki wieloletniemu zaangażowaniu w zapewnianie wyjątkowej opieki nad pacjentami, szkoleniu nowych pokoleń pracowników służby zdrowia dziecięcej oraz przełomowym kluczowym inicjatywom badawczym szpital na 595 łóżek przyczynił się do wielu odkryć, które przyniosły korzyści dzieciom na całym świecie. Jego program badań pediatrycznych należy do największych w kraju. Organizacja ma ugruntowaną historię świadczenia zaawansowanej opieki pediatrycznej blisko domu Sieć opieki CHOPktóra obejmuje ponad 50 przychodni podstawowej opieki zdrowotnej, opieki specjalistycznej, centrów chirurgicznych, ośrodków pilnej opieki i sojuszy szpitali społecznościowych na całym świecie Pensylwania I New Jerseya także a Nowy szpital stacjonarny Z dedykowanym oddziałem ratunkowym dla dzieci w Królestwie Prus. Ponadto wyjątkowe, skoncentrowane na rodzinie programy opieki publicznej i usług przeniosły Szpital Dziecięcy na wyższy poziom Filadelfia Uznanie za wiodącego orędownika dzieci i młodzieży. po więcej informacji odwiedź http://www.chop.edu.

Komunikacja: Dana Baty
Szpital Dziecięcy Filadelfia
(267) 426-6055
[email protected]

ŹRÓDŁO Szpital Dziecięcy Filadelfia